수행 시기 : 임상 1상 전에 그리고 임상 3상 전에 즉 main study 전에 반드시 수행되어야 합니다.

목적 : Phase 1을 위한 조건 설정

Virus : 1종

Run : Single

Process : Removal 1개

Cytotoxicity Test & Interference Test 수행이 되어야 합니다.

수행 시기 : 임상 1상 단계 / 인체에 대한 안전성 확보를 위해 제출 (바이러스 제거 검증), 시험법 적합성에 대한 것

목적 : 임상 1상 진행 서류 제출

Virus : 2종 (이상)

Run : Duplicate

Process : Removal 1개 / Inactivation 1개

두 가지 모델 바이러스 검증 적용 (바이러스 종류에 대해서는 논의)

수행 시기 : 임상 3상 단계

목적 : 임상 3상 진행 서류 제출

Virus : 4종 (이상)

Run : Duplicate

Process : Removal 2개 / Inactivation 1~2개

임상 3상시 임상시험용 의약품의 사용 전에 Virus clearance 검증 완료해야 함

네 가지 바이러스 검증 적용 (Application에 따라 바이러스 종류 및 검증 수가 다름)

그 변경사항이 제거/불활화에 직접 또는 간접적인 영향을 미치는가를 고려하여 재검증
Virus Clearance Study를 진행 (BioOutsource, 싸토리우스 lab, 찰스리버, 우시, BioReliance)

생산공정에서 clearance 위해 사용되는 제품이 다른 제품으로 변경되는 경우
Virus Clearance Study를 진행 (BioOutsource, 싸토리우스 lab, 찰스리버, 우시, BioReliance)

생산 site가 변경될 경우 변경된 site에서 재검증을 실시 적용된 모든 virus clearance에 대하여 재검증해야 할 확률이 높음

Cytotoxicity Test (독성시험)

Assay cell에 대한 공정 시료의 독성 여부 확인

Interference Test (간섭 시험)

TCID50분석 시 바이러스가 assay cell을 감염시키는 데 공정 시료가 방해하는지를 확인

Cytotoxicity Test에서 확인된 시료 희석배수에 대한 적절성 평가

예비 시험을 통해 시료의 희석배수를 결정한 후 본시험 진행

Virus Clearance Study 수행은 국내 그리고 해외 이렇게 두 곳에서 진행할 수 있습니다.

국내 판교 Lab

해외 BioOutsource Glasgow
영국 사이트에서 진행이 가능합니다.
Todd Campus, West of Scotland Science Park, 1 Technology Terrace, Acre Rd, Glasgow G20 0XA 영국
GLP 인증 완료
2022년 중순부터 시험 진행 중

Questionnaire 작성 작성이 완료된 Questionnaire를 싸토리우스 담당자에게 전달

견적 안내 Questionnaire의 정보를 바탕으로 VCS 수행 가능 여부를 판단하며, 이후 고객사에 견적 안내

견적 확인 견적서 상 Test scope에 대한 상세 확인 진행

발주 접수 VCS 진행에 대하여 계약 체결

프로토콜 작성, 검토 및 승인 발주 접수 후 시험 담당자가 프로토콜 작성 및 시험 진행과 관련하여 questionnaire에 작성된 고객사 담당자에게 연락.
1 ~ 2주 정도 소요됩니다. 담당 직원이 protocol을 작성하여 전달 드리며, 고객의 검토 및 승인을 요청

VCS 수행

레포트 작성

검토 및 승인

완료

계약 및 발주 기간을 제외하고 검체 발송부터 보고서 초안 전달까지 소요되는 기간

예비시험: 약 4주

Cytotoxicity

Interference

본시험: 시험 당 약 6~8주

Chromatography

Low pH treatment

Virus Filtration

etc.

* 바이러스 종류에 따라 기간이 달라질 수 있으므로 정확한 기간은 DSP팀에 문의 필요

바이러스의 assay cell 감염 효과 측정

전체 세포의 50%를 감염시키는 바이러스의 희석 배수가 TCID50

해당 값을 통해 바이러스 정량분석

Log Reduction Factor (LRF)으로 나타내기도 함

공정 전/후 바이러스의 감소 정도를 나타냄

시료	부피	정량분석
초기 공정 시료	100mL	5 x 10^8 TCID50/ml
공정 후 시료	10mL	5 x 10^4 TCID50/mL

* Log(5x10^8x100) – Log(5x10^4x10) = 5

일반적으로 바이오 의약품 생산 공정은 바이러스 불활화 또는 제거를 위해 열처리, S/D 처리, 바이러스 필터 공정 등과 같은 의도적인 (intentional) Virus clearance 공정을 포함하고 있습니다. 바이러스 안전성 보증을 위해 생산 공정 중 바이러스의 제거 및 불활화가 일어날 수 있는 전 과정을 검증하는 것이 중요합니다.

전 과정을 검증해야 하는 경우
→ 생산 site의 변경 / 임상 3상을 시행 전 완료되어야 함
일부 과정에 대해서만 검증하는 경우
→ 주로 생산에서 공정 개발에 의한 일부 정제 공정의 변경 / 또는 사용 제품의 변경

즉 변경된 부분이 virus 제거 및 불활화에 영향을 미치는지에 대해 검증 즉 이 첫 단계는 어떤 clearance 공정에 대해서 검증할 것인지 scope을 정하는 것이라 볼 수 있습니다.

같은 기작에 의해서 바이러스 제거 또는 불활화가 일어나는 공정을 다 검증할 필요는 없습니다. 생산 공정 중 열처리를 독립적으로 두 번 진행하거나 또는 기작이 같은 크로마토그래피를 두 번 진행한다고 했을 때 각 공정을 다 검증할 필요는 없다는 것입니다. 서로 다른 기작에 의해서 바이러스의 제거 또는 불활화가 일어나는 공정들의 결과만이 결과의 해석을 위해 합산될 수 있다는 의미 입니다.

GMP 기준으로 어떤 바이러스라도 생산공정에 투입되는 것을 금하고 있습니다. 생산 규모의 scale로 바이러스 clearance study를 하는 것은 불가능하므로 virus clearance study는 따로 분리된 바이러스 연구 시설에서 scale-down된 공정을 사용하여 생산기술자와 바이러스 연구에 능숙한 연구원과의 협동으로 수행되어야 합니다.

또한 시험은 비임상시험기준(GLP)에 따라야 합니다. 생산 공정의 scale-down 및 scale-down 공정의 검증은 바이러스 clearance 검증 study를 위해 필수적입니다.

Scale-down에 대한 규정된 지침은 없으나 일반적으로 → 1/100~1/1000
가장 중요한 것은

Scale-down 공정이 가능한 한 생산 공정과 유사해야 함

공정상의 parameter (pH, 온도, 단백질과 다른 성분들의 농도, 잔응시간, column bed의 높이, 세척 및 용출액의 linear flow rate) 등을 비교 검증하여야 함

연속적인 3회 이상의 scale-down 공정의 검증 결과가 생산공정의 검증 결과와 일치하여야만 바이러스 clearance검증 결과가 의미를 갖습니다.

검증 바이러스 선정 시 고려해야 할 사항은

검증을 위해 사용될 바이러스는 제품에 오염 가능성이 있는 바이러스 그 차제 또는 가장 유사한 바이러스이어야 함.

선택된 바이러스는 되도록 물리, 화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것이어서 다른 미지의 또는 동정되지 않은 바이러스의 clearance를 보장할 수 있어야 함.

검증용 바이러스는 되도록 쉽게 분석 가능하며, 고농도로 배양할 수 있어야 함

선택된 바이러스는 검증하는 실험 기간 동안 실험자에게 감염의 위험이 적어야 함.

예를 들어 혈장 유래 의약품의 검증 연구를 위해서 사용되는 바이러스는 혈장에 오염 가능성이 있는 바이러스에 대한 relevant 바이러스 및 모델 바이러스로 구분할 수 있으며, 검증용 바이러스는 CPMP guideline에 따라 선택되어야 합니다.
HIV-1은 retrovirus의 lentivirus family에 속하는 enveloped, medium-sized, single-stranded RNA 바이러스로 사람의 혈액 또는 혈장으로부터 유래된 의약품의 경우 검증에 꼭 사용되어야 합니다.

Virus Clearance Study는 검증 공정의 출발 물질에 바이러스를 spiking한 후 공정을 진행하면서, 단계별로 시료를 분획하고, 분획된 시료를 배양세포에 접종하여 감염성 바이러스 입자의 수를 확률적으로 산출하는 과정을 통해 진행됩니다.

이때 공정 시료가 배양세포에 cytotoxic하다면 바이러스의 정량 분석이 어렵게 됩니다. 따라서 spiking 실험 전에 미리 생산 공정에서 또는 scale-down 공정에서 취한 공정 시료를 일정한 배수로 희석하여 배양세포에 접종한 후 배양하면서 cytotoxicity를 나타내지 않는 범위의 희석배수를 구합니다. 공정 시료가 cytotoxicity를 나타내지 않는 범위의 희석배수를 구하는 것입니다.

공정 시료가 cytotoxicity를 나타내지 않는 범위로 희석되어 배양세포에 접종된다 할지라도 공정 시료에 존재하는 성분이 바이러스의 증식을 억제할 수도 있습니다. 이러한 interference를 검사하기 위해 배양세포에 non-cytotoxic한 범위로 희석된 공정시료를 배양세포에 접종한 후 바이러스를 일정한 희석배수로 희석하여 접종을 합니다.

대조구로 공정시료를 첨가하지 않은 배양세포에 바이러스를 접종하여 감염 정도를 비교하여 interference를 측정합니다. 즉 cytotoxicity와 interference 검사는 정확한 바이러스의 정량 분석을 위해 공정 시료를 얼마나 희석해야 하는지를 결정하는 과정이라 할 수 있습니다. 이 검사는 반드시 1상 그리고 3상 전에 미리 진행되어야 합니다.

검증 시험을 위해 spiking되는 바이러스의 양은 생산 공정 중 바이러스가 제거 또는 불활화되는 능력을 정량화하기 위해서 가능하면 많을수록 좋습니다.
하지만 투입되는 바이러스로 인해 생산 원료의 조성이 변화되어 공정상의 변화가 야기되지 않아야 합니다.
일반적으로 투입하는 바이러스 시료의 부피는 공정 출발 시료의 10% 이내입니다.

Virus Clearance Study를 위한 바이러스 정량 분석은 시료를 배양세포에 접종하여 감염성 바이러스 입자의 수를 확률적으로 계산하는 것이 바람직합니다.
감염성 바이러스는 50% Tissue Culture Infection Does (TCID50) 또는 plaque formation unit로 정량 분석됩니다.

바이러스 정량 분석이 끝나면 그 결과를 기초로 각 공정에서 바이러스가 얼마나 제거 또는 불활화 되었는지 바이러스 감소값 (Virus reduction factor)을 구하게 됩니다.
Virus reduction factor는 바이러스가 spiking된 공정 출발 물질에 존재하는 바이러스 양의 log10 값에서 공정 진행 후 활성 분획에 존재하는 바이러스 양의 log10 값을 뺀 Log Reduction Factor로 정의됩니다. 또는 spiking 하는 stock 바이러스의 양을 기준으로 계산된 값을 Log Clearance Factor 라고 정의 하고 있습니다.

예시
크로마토그래피 공정에서 95ml의 공정 초기 물질에 5ml의 바이러스를 spiking한 후 바이러스를 정량 분석하였더니 5 x 10^8 TCID50/ml이었고, 공정 진행 후 활성 분획을 10ml 분획하여 바이러스를 정량 분석하였더니 5 x 10^4 TCID50/ml이었다면 Log Reduction Factor는 다음과 같이 계산됩니다.

log10(5 x 10^8 x 100) – log10(5 x 10^4 x 10) = 5
일반적으로 생산공정의 바이러스 clearance 효율은 개별 공정들의 Log Reduction Factor를 합한 cumulative log reduction factor로 표현됩니다. 개별 공정 단계에서 2~4 log reduction 값 정도만 나와도 효과적이라 볼 수 있습니다.